TUNEL細胞凋亡檢測 (TUNEL Apoptosis Assay)是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品，經過生物素標記和后續(xù)的DAB顯色等步驟，即可在普通光學顯微鏡下觀察到凋亡細胞。

細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現180-200bp的DNA ladder。

基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合，zui后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞。

技術步驟

1. 材料與試劑 (以Promega試劑盒為例)，包括：

(1)生物素標記的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/µL

(2)TdT酶（25U/μL）

(3)反應緩沖液

(4)洗滌緩沖液

(5)異硫氰酸熒光素（FITC）標記的親合素或鏈霉親合素（2.5µg/mL）或抗地高辛抗體（1︰30）

(6)PI染液（含PI 5µg/mL及無DNA酶活性的RNA酶0.1%）

(7)PBS緩沖液

(8)塑料蓋玻片

2. 樣品

(1)懸浮生長培養(yǎng)細胞的甩片或涂片

(2)貼壁生長的培養(yǎng)細胞

(3)冰凍切片

(4)常規(guī)石蠟切片

3. 操作方法

(1)固定：培養(yǎng)細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。

(2)洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min，三次。

(3)反應：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加反應液（每50μL反應液含TdT酶0.5μL,標記的-dUTP 1μL），使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上，蓋上塑料蓋玻片，置濕盒中，37℃孵育1h。

(4)終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內，洗滌兩次，每次5min。

(5)FITC標記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/cm2滴加FITC反應液（含FITC 2.5μg/mL），室溫下避光孵育10min。

(6)洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內，洗兩次，每次5min。

(7)PI復染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內，室溫下避光染色30min。

(8)封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。

4. 結果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發(fā)光（波長488nm），所有的細胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標記上FITC，顯示出黃綠色熒光。

應用領域

細胞凋亡(apoptosis)的分析方法，細胞凋亡有一項重要的特征為細胞內的DNA會碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探測DNA片段的產生。

服務周期

交貨時間： 15~20天

客戶須知（對材料的要求、注意事項）

結果提供： 正常和陽性對照玻片及其1張數碼照片，剩余石蠟塊，檢測報告；

樣本要求：取材保持組織新鮮（組織塊以小于2cm×1.5cm×0.3cm為宜），立即放入固定液（固定液用10%福爾馬林液或4%多聚甲醛緩沖液，體積為組織塊的10倍以上）中，避免干燥；對于有血跡的樣本，可用PBS液或生理鹽水沖洗后直接放入固定液中；經固定后的樣本必須在48小時內處理。

血清是一種成分復雜的混合物，不同批次血清對細胞生長的促進作用不同。大規(guī)模細胞培養(yǎng)中由血清引起的細胞生長狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現在以下幾個方面：

1、細胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；從同一細胞瓶中分出兩瓶細胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入10％的對照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng)72小時，會出現對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有60～70％，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細胞。

2、細胞傳代后形態(tài)不正常，細胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質量問題，使原本狀態(tài)正常的細胞經傳代后形態(tài)會變差；比如：細胞瓶里會出現一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細胞表面形成一層油狀覆蓋物；細胞的輪廓變得模糊，細胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細胞向四周擴展生長。

3、細胞傳幾代后就出現脫壁現象，不能連續(xù)傳代 ；質量較差的血清缺乏某種細胞的貼壁因子，會使細胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細胞會從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現象就是細胞表面不光滑，晃動細胞瓶會看到細胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動。隨著傳代次數增加，細胞萎縮的情況越來越嚴重，直到zui終*脫壁而死亡。

4、細胞長的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會把接進去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當大的，不產毒等于前面所做的那么多工作全部白費，浪費人力、物力，尤其是時間上的浪費，從培養(yǎng)細胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個月，一旦出現不產毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風險之一。

5、細胞生長的狀態(tài)一般，產毒少，毒價低。這種情況比較常見，細胞是病毒的載體，由于血清質量不好，導致細胞生長狀態(tài)不好，病毒就無法進行正常的復制。并非所有病毒都不能復制，所以就造成疫苗的效價不夠，可能造成不合格產品。

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產品名稱    貨號    來源    規(guī)格    市場價格

胎牛血清FBS Sv30087.01  SOUTH AMERICA   100ML   800

胎牛血清FBS Sv30087.02  SOUTH AMERICA   500ML   1800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

優(yōu)等胎牛血清FBS SH30084.03  AUSTRALIA   500ML   5800

特級胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30396.03  Canada  500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30070.03  USA 500ML   3900

特級胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

特級胎牛血清FBS SH30070.03E USA 500ML   5600

標準胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

標準胎牛血清FBS SH30370.03  AUSTRALIA   500ML   2800

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清Charcoal Stripped FBS  SH30068.03  USA 500ML   6000

活性炭/葡聚糖處理胎牛血清，熱滅活，Charcoal Stripped FBS    SH30068.03HI    USA 500ML   6000

新生牛血清New born calf serum   SH30406.01  New Zealand 500ML   1300

馬血清Horse Serum   SH30074.03  USA 500ML   980